DNS-Fehérje Kölcsönhatások

Kutatás

Az irányított DNS-metiláció eszköztárának fejlesztése

Emlősök DNS-ében a CG dinukleotidokban lévő citozinok C5-metilációja az epigenetikus szabályozás fontos komponense, amelynek kulcsszerepe van több életfolyamatban, pl. az X-kromoszóma inaktivációban és a genomikus imprintingben. A genomi metiláció mintázata összefügg a sejt funkciójával, a szövetspecifikus génkifejeződéssel. Egyre több bizonyíték mutat arra, hogy a rendellenes DNS-metiláció szerepet játszik több betegség, így a rák patogenezisében is. Bár általánosan elfogadott, hogy az emlős gének promoterének metilációja a gén kikapcsolásához vezet, messze vagyunk annak megértésétől, hogy az egyes gének szabályozásában a DNS metilációnak milyen szerepe van, és hogy a DNS metiláció hogyan integrálódik az epigenetikus szabályozás bonyolult hálózatába. Az irányított DNS metiláció, azaz kiválasztott genomikus helyek szelektív metilálása hasznos kutatási eszköz lehet az ilyen kérdések megválaszolására. Az irányított DNS metilációra kidolgozott módszerek az 1997-ben közölt úttörő munka (1) alapelvét használják: egy CG-specifikus C5-metiltranszferázt kovalensen egy szekvenciaspecifikus DNS-kötő fehérjéhez kapcsolnak, amely a célzott genomi helyhez kötődik ezáltal lehetővé téve azt, hogy a hozzá fúzionált metiltranszferáz a térben közel lévő CG helyeket metilálja. Korábbi munkákban elsősorban cink-ujj fehérjéket használtak irányító modulként, ezek helyét újabban a katalitikusan inaktív dCas9 vette át (2). A javítások ellenére a módszer nem kellően specifikus, azaz nem célzott helyek is metilálódnak (2,3).

            Azt vizsgáljuk, hogy különböző faktorok, mint pl. a metiltranszferáz katalitikus aktivitása és DNS szubsztráthoz mutatott affinitása hogyan befolyásolják az irányított DNS metiláció specifitását. Ehhez a munkához Escherichia coli rendszert, a CG-specifikus M.SssI bakteriális metiltranszferázt és cink-ujj fehérje valamint CRISPR-dCas9 irányítódomént használunk.

         Emlősök bizonyos sejttípusaiban az uralkodó CG mellett kisebb gyakorisággal  nem-CG (elsősorban CA) –specifikus citozin-metiláció is kimutatható. A nem-CG (CH, azaz CA/CC/CT) metilációnak a biológiai szerepét nem ismerjük (4). A célunk a CG-specifikus M.MpeI bakteriális metiltranszferáz olyan változatainak előállítása, amelyek szubsztrátsepecifitása CG-ről CH-ra változott. Ehhez a munkához az M.MpeI-et nagy aktivitása és a publikált kristályszerkezet (5) miatt választottuk. A tervezett CH-specifikus M.MpeI mutánsok hasznos eszközei lehetnek a nem-CG-specifikus DNS-metiláció kutatásának. Továbbá, a mutáns enzimek vizsgálata kiegészítheti az M.MpeI-DNS komplex kristályszerkezetéből (5) nyert információt és hozzájárulhat a szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatások megértéséhez.

I-Block: egy egyszerű módszer szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára E. coliban

A szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kölcsönhatások alapvető fontosságúak a génkifejeződés szabályozásában. A DNS-kötő fehérjék jellemzése során sokszor meg kell vizsgálni, hogy a fehérje kötődik-e egy bizonyos DNS-szekvenciához, és hogy a fehérjében vagy a DNS-ben előidézett változások hogyan befolyásolják a kötődés erősségét és/vagy specifitását. A publikált módszereknek vannak hátrányai: az  in vitro módszerekhez tisztított fehérje kell, míg az E. coli rendszerben működő módszerekhez fehérjefúziók létrehozása szükséges.

Csoportunkban kidolgoztunk egy egyszerű módszert (I-Block), amely alkalmas szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kötés kimutatására E. coli sejtekben. A módszer azt méri, hogy a vizsgált fehérje mennyire gátolja az RNS-polimeráznak egy olyan lacI  promoterhez való kötődését, amely átfed a vizsgált fehérje feltételezett kötőhelyével. A targethelyéhez kötődő fehérje gátolja a lacI gén transzkripcióját, ami a β-galaktozidáz aktivitás növekedését eredményezi (6). 

Az I-Block módszer jelenlegi állapotában annak vizsgálatára alkalmas, hogy egy fehérje tud-e kötődni egy adott DNS szekvenciához E. coliban. A célunk  a módszernek olyan irányú fejlesztése, amelynek révén alkalmassá válik arra, hogy nagy komplexitású könyvtárból ki tudjunk szelektálni egy adott DNS-szekvenciához legjobban kötődő fehérjeváltozatot, ill. egy adott fehérjéhez legjobban kötődő DNS-szekvenciát.

Irodalmi hivatkozások

1. Xu, G.L. and Bestor, T.H. (1997) Cytosine methylation targetted to pre-determined sequences. Nat Genet, 17, 376-378.
2. Lei, Y., Huang, Y.H. and Goodell, M.A. (2018) DNA methylation and de-methylation using hybrid site-targeting proteins. Genome Biol, 19, 187.
3. Galonska, C., Charlton, J., Mattei, A.L., Donaghey, J., Clement, K., Gu, H., Mohammad, A.W., Stamenova, E.K., Cacchiarelli, D., Klages, S. et al. (2018) Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun, 9, 597.
4. He, Y. and Ecker, J.R. (2015) Non-CG Methylation in the Human Genome. Annu Rev Genomics Hum Genet, 16, 55-77.
5. Wojciechowski, M., Czapinska, H. and Bochtler, M. (2013) CpG underrepresentation and the bacterial CpG-specific DNA methyltransferase M.MpeI. Proc Natl Acad Sci U S A, 110, 105-110.
6. Szentes, S., Zsibrita, N., Koncz, M., Zsigmond, E., Salamon, P., Pletl, Z. and Kiss, A. (2020) I-Block: a simple Escherichia coli-based assay for studying sequence-specific DNA binding of proteins. Nucleic Acids Res, 48, e28.