Kémiai Biológiai Laboratórium

Kutatási terület                          

A csoportunkban folytatott kutatások a fehérje – kis molekula kölcsönhatások, valamint fehérjék működési mechanizmusának megértésére irányulnak. Spektroszkópiai, elméleti, valamint in vitro kísérletes vizsgálatokkal szerkezet – hatás/funkció összefüggések megállapítására törekszünk olyan jelentős gyógyszer célpontokhoz, mint például az opoid, kannabinoid, vazopresszin vagy szigma receptorok. A vizsgálatokhoz szükséges, izotópokkal, fluorofórokkal jelzett vagy nem természetes építőkövet tartalmazó kismolekulák, peptidek, fehérjék előállítására szintetikus kémiai módszereket dolgozunk ki.

Membrán-asszociált fehérjék, kannabinoid, vazopresszin és szigma receptorok (PI: Tömböly Cs.)

1. Félszintetikus lipoproteinek exogén módon történő plazma membránba juttatása lehetővé teszi a sejtmembrán tervezett és kontrollált módosítását. Így ez a stratégia alkalmas membránfehérjék dinamikai vizsgálatára, membránfehérjék sejten belüli körforgásának tanulmányozására, valamint biológiailag aktív fehérjék és terápiás sejtek hatásosságának növelésére. Erre a célra egy olyan módszert dolgoztunk ki, amely lehetővé teszi, hogy élő sejtekkel kompatibilis körülmények között építsünk funkcionális fehérjéket a sejtmembrán felszínére. Bemutattuk, hogy amfifil koleszterin származékokkal kapcsolt fehérjék élő sejtek membránjának külső rétegébe horgonyozhatók. Az optimalizált koleszterin származékok vízoldékonyak, nem toxikusak és detergensek nélkül alkalmazhatók sejtkultúrákban. Mivel a horgony molekulák fejcsoportja fluoreszcens vagy radioaktív jelet tartalmaz, így lehetővé teszik a kapcsolt fehérje direkt képalkotásos leképezését. Továbbá a koleszterin képes a szfingolipidek környezetében dúsulni, ezért a koleszterin alapú horgony molekulák alkalmasak a kapcsolt fehérjék lipid raftokba történő bejuttatására is. A horgony molekuláink mindezen tulajdonságainak bemutatására az mCherry fluoreszcens fehérje, valamint a teljes hosszúságú prion fehérje C-terminmális végéhez kapcsoltunk koleszterin horgonyt, majd a kapott lipoproteineket SHSY-5Y neuroblasztóma sejtek membránjába horgonyoztuk. A koleszterin horgonyok membránbeli elhelyezkedésének atomi részleteit elméleti módszerek segítségével írtuk le.

2. A kannabinoid receptorok jelátviteli folyamatait moduláló vegyületek számos neurológiai betegség, pszichiátriai kórkép, neuropátiás fájdalom vagy az elhízás kezelésében terápiás jelentőséggel bírnak. Célunk olyan, csak kannabinoid vagy opioid és kannabinoid receptorokon egyaránt ható vegyületek előállítása, amelyek krónikus fájdalom kezelésében alkalmazhatóak és kedvező mellékhatás profillal rendelkeznek. A szintetizált vegyületek farmakológiai és jelátviteli tulajdonságait in vitro szövetpreparátumokon, in vivo hatékonyságukat pedig gyulladásos és neuropátiás állatmodelleken vizsgáljuk.

3. Az NSZKK, Bűnügyi Igazságügyi Szakértői Igazgatóság, Kábítószervizsgáló Szakértői Intézetével együttműködve újonnan azonosított, illegális szintetikus kannabinoidok szerkezeti és farmakológiai jellemzésében veszünk részt. A vegyületek kannabinoid és más G fehérje-kapcsolt receptorokkal kialakított kölcsönhatásait vizsgáljuk in vitro kísérletekben, továbbá in vivo körülmények között mérjük a kardiovaszkuláris rendszerre gyakorolt hatásaikat. A szintetikus kannabinoidok között számos olyan új vegyület válik ismertté, melyek nagyon hatékonyan aktiválják a kannabinoid 1 típusú receptorokat, emiatt ezek rendkívül veszélyesek, túladagolásuk akár halálos kimenetellel is végződhet. Ilyen szintetikus kannabinoidok hatását kompenzáló gyógyszer nem áll rendelkezésre. Ebből a célból vizsgáljuk a pepcan peptidcsalád tagjait, amelyek pszichoaktív mellékhatások nélküli hatóanyag alapjait jelenthetik.

4. A szigma-1 receptor egy intracelluláris, nem G-fehérje kapcsolt receptor és dajkafehérje, amely változatos szerkezetű ligandumokkal képes kölcsönhatást kialakítani. A szigma-1 receptor elsődleges fiziológiai funkciója a Ca²⁺ jelátvitel modulációja, a feszültségfüggő K⁺-csatornák, valamint neurotranszmitterek felszabadulásának gátlása. Mivel a szigma-1 receptor agonisták neuroprotektív hatást mutatnak sejtes- és állatmodellekben, ezért neurodegeneratív betegségek kezelésére alkalmas hatóanyagok lehetnek. Kutatásaink során optimalizáltunk egy radioligandum kötési módszert és egy vegyületkönyvtár szűrésével azonosítottunk olyan új szerkezeti elemeket, amelyek szigma-1 receptorokat célzó hatóanyagok farmakológiai fejlesztésének alapját képezik.

A G fehérje-kapcsolt receptorok működésének szerkezeti mechanizmusa. (PI: Borics A.)

A G fehérje-kapcsolt receptorok (GPCR-ek) a human genom egyik legnagyobb fehérjecsaládját alkotják és számos alapvető élettani funkcióban vesznek részt. Ennek következtében a  GPCR-ek sok betegség kialakulásában is szerepet játszanak., melynek köszönhetően a kereskedelmi forgalomban lévő, vényköteles gyógyszerek hozzávetőlegesen 34%-át e receptorcsalád tagjait célzó készítmények teszik ki. Számos GPCR atomi részletességű, aktív és inaktív állapotú szerkezete ismeretes de az aktív és inaktív állapotok közötti átalakulás szerkezeti mechanizmusa még nem teljesen ismert. Kutatásaink során ligandum-receptor kölcsönhatások szerepét vizsgáljuk a receptor elektrosztatikai egyensúlyára gyakorolt hatásuk tükrében, a receptorcsalád általános sajátságainak megismerését célozva.  Vizsgálataink egy új szermlélet bevezetésén alapulnak, mely a receptor belsejében lévő töltéeloszlásra fektet hangsúlyt. Legfrissebb molekuladinamikai szimulációs viszgálataink során kimutattuk, hogy a m-opioid receptor esetében a külső stimulus a 7. transzmembrán helixen elhelyezkedő, fokozottan konzervált, poláris aminosav oldalláncok korreláló mozgásai útján továbbítódik a receptor intracelluláris felszíne irányába. E megfigyelés alapján feltételezzük, hogy a GPCR-ek aktivációjának kiindulási lépése az ortosztérikus ill. allosztérikus kötőhelyek és az intracelluláris G fehérje-kötő felület közötti töltésegyensúly-eltolódás. Jövőbeli terveink e vizsgálat további A osztályú GPCR-ekre való kiterjesztését és a fenti hipotézis kísérleti igazolását célozzák kölcsönhatás-specifikus ligadumok és receptor mutánsok tervezése, illetve in vitro funkcionális tesztek és STDD-NMR vizsgálatok segítségével.

A csoport által felkínált M. Sc. szakdolgozati és Ph. D. kutatási témák

Tömböly Cs.

1. A fluoreszcens koleszterin horgony molekulák általános alkalmazhatóságát korlátozza, hogy a kapcsoláshoz szükséges a fehérje C-terminális végén lévő cisztein jelenléte. Amennyiben a fehérje további cisztein egységeket is tartalmaz a horgony molekula C-terminális ciszteinhez történő specifikus kapcsolása nem kivitelezhető. Ezen nehézség áthidalására és ezáltal a koleszterin horgonyok sejtfelszín módosításban való elterjedéséhez a célfehérjék C-terminális végére, illetve a koleszterin horgonyok fejcsoportjába építhető bioortogonális funkciós csoport párok alkalmazhatóságát vizsgáljuk.

2. Citokinek és a prion fehérje totálszintézisét vizsgáljuk azzal a céllal, hogy spektroszkópiai és funkcionális vizsgálatokat támogató, kémiai információban (fluorofórok, stabil izotópok, nem természetes aminosavak, poszttranszlációs módosítások) gazdagabb fehérje származékokat kapjunk. Erre a célra natív kémiai és ciszteint nem igénylő kémiai ligációs stratégiákat fejlesztünk.

3. A kannabinoid receptorok endogén peptid ligandumaiból (pepcan) kiindulva olyan szintetikus peptidek előállítását, in vitro és in vivo vizsgálatát végezzük, amelyek pszichoaktiv mellékhatások kiváltása nélkül képesek a kannabinoid receptorokkal kölcsönhatást kialakítani.

Borics A.

1. A G fehérje-kapcsolt receptorok aktivációs mechanizmusának vizsgálata a közelmúltban publikált nagy felbontású, hármodimenziós szerkezetek és korszerű molekulamodellezési módszerek alkalmazásával.

2. A plazma-membrán összetétele és specifikus lipid-fehérje kölcsönhatások G fehérje-kapcsolt receptorok aktivációs mechanizmusát befolyásoló hatásának viszgálata.

3. Specifikus, G fehérje-kapcsolt receptorokkal farmakofor kölcsönhatásokat kialakító peptid ligandumok tervezése, szintézise és farmakológiai jellemzése.

Szakmai háttér

- Fehérjék szintézise és kémiai módosítása

- GPCR ligandumok tervezése és szintézise

- Bioaktív vegyületek radioaktív (H-3, C-14, I-125) vagy fluoreszcens jelölése

- Radioligandum receptor kötési vizsgálatok (kinetikai, telítési és kompetíciós mérések, [³⁵S]GTPgS funkcionális kötődési vizsgálatok)

- Radioaktívan jelzett vegyületek in vivo szövet megoszlási mérése

- In vivo fájdalom modellek (von-Frey teszt)

- Komplex biológiai rendszerek modellezése atomi szinten.

- Gyógyszerjelölt molekulák, kisebb könyvtárak in silico jellemzése, szűrése. Kötési affinitás és farmakofor kölcsönhatások előrejelzése.

- Fehérjék és peptidek másodlagos szerkezetének, stabilitásának és kölcsönhatásainak vizsgálata optikai spektroszkópiai módszerekkel.
- Illegális szintetikus kannabinoidok igazságügyi, farmakológiai vizsgálata

Folyamatban lévő együttműködések

Borics A.

Design, synthesis and structural and functional characterization of novel opioid receptor ligands

Anna Janecka

Medical University of Łódź, Department of Biomolecular Chemistry (Poland)

Structural characterization of small, cysteine-rich antimicrobial proteins of fungal origin

László Galgóczi^1,2, Florentine Marx², Gyula Batta³, José F. Marcos⁴

¹University of Szeged, Faculty of Sciences, Department of Microbiology (Hungary)

²Innsbruck Medical University, Division of Molecular Biology (Austria)

³University of Debrecen, Department of Organic Chemistry (Hungary)

⁴Department of Biotechnology, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (Spain)

Válogatott közlemények

Mitra, A.; Sarkar, A.; Szabó, M. R.; Borics, A.

Correlated motions of conserved polar motifs lay out a plausible mechanism of G protein-coupled receptor activation.

https://doi.org/10.1101/2020.01.27.920769

Dvorácskó, Sz; Keresztes, A.; Mollica, A.; Stefanucci, A.; Macedonio, G.; Pieretti, S.; Zádor, F.; Walter, F.R.; Deli, M.A.; Kékesi, G.; Bánki, L.; Tuboly, G.; Horváth, Gy.; Tömböly, Cs. Preparation of bivalent agonists for targeting the mu opioid and cannabinoid receptors. EUR J. MED. CHEM. 2019, 178, 571-588.

M.P. Dimmito, A. Stefanucci, S. Pieretti, P. Minosi, Sz. Dvorácskó, Cs. Tömböly, G. Zengin, A. Mollica “Discovery of Orexant and Anorexant Agents with Indazole Scaffold Endowed with Peripheral Antiedema Activity.” Biomolecules 9(9), 492 (2019).

Corbani, M., Marir, R., Trueba, M., Chafai, M., Vincent, A., Borie, A.M., Desarménien, M.G., Ueta, Y., Tömböly, Cs., Olma, A., Manning, M., Guillon, G. “Neuroanatomical distribution and function of the vasopressin V_1B receptor in the rat brain deciphered using specific fluorescent ligands.” Gen. Comp. Endocrinol. 258, 15-32 (2018).

Adamska-Bartlomiejczyk, A.; Janecka, A.; Szabó, M. R.; Cerlesi, M. C.; Calo, G.; Kluczyk, A.; Tömböly, Cs.; Borics, A.

Cyclic mu-opioid receptor ligands containing multiple N-methylated amino acid residues

BIOORG. MED. CHEM. LETT. 2017, 1644-1648.

Schäfer B.; Orbán, E.; Fiser, G.; Marton, A.; Vizler, C.; Tömböly, Cs.

Semisynthesis of membrane-anchored cholesteryl lipoproteins on live cell surface by azide–alkyne click reaction.

TETRAHEDRON LETT. 2016, 57, 868-873.

Váradi, A.; Marrone, G. F.; Palmer, T. C.; Narayan, A.; Szabó, M. R.; Le Rouzic, V.; Grinnell, S. G.; Subrath, J. J.; Warner, E.; Kalra, S.; Hunkele, A.; Pagirsky, J.; Eans, S. O.; Medina, J. M.; Xu, J.; Pan, Y. X.; Borics, A.; Pasternak, G. W.; McLaughlin, J. P.; Majumdar, S. Mitragynine/Corynantheidine Pseudoindoxyls As Opioid Analgesics with Mu Agonism and Delta Antagonism, Which Do Not Recruit beta-Arrestin-2.

J. MED. CHEM. 2016, 59, 8381-8397.

Dvorácskó, Sz.; Tömböly, Cs.; Berkecz, R.; Keresztes, A.

Investigation of receptor binding and functional characteristics of hemopressin(1-7)

NEUROPEPTIDES 2016, 58, 15-22.

Dvorácskó, Sz.; Stefanucci, A.; Novellino, E.; Mollica, A.

The design of multitarget ligands for chronic and neuropathic pain

FUTURE MED. CHEM. 2015, 7, 2469-2483.

Orbán, E.; Kele, Z.; Tömböly, C.

Tritium labelling of a cholesterol amphiphile designed for cell membrane anchoring of proteins.

J. LABELLED COMPD. RAD. 2015, 58, 7-13.

Schäfer, B.; Orbán, E.; Borics, A.; Huszár, K.; Nyeste, A.; Welker, E.; Tömböly, Cs.

Preparation of Semisynthetic Lipoproteins with Fluorescent Cholesterol Anchor and Their Introduction to the Cell Membrane with Minimal Disruption of the Membrane.

BIOCONJ. CHEM. 2013, 24, 1684−1697.

Borics A, Mallareddy JR, Tímári I, Kövér KE, Keresztes A, Tóth G.

The Effect of Pro(2) Modifications on the Structural and Pharmacological Properties of Endomorphin-2.

J. MED. CHEM. 2012, 55, 8418-8428.

Borics, A.; Tóth, G.

Structural comparison of mu-opioid receptor selective peptides confirmed four parameters of bioactivity.

J. MOL. GRAPH. MODEL. 2010, 28, 495-505.

Tömböly, Cs.; Ballet, S.; Feytens, D.; Kövér, K. E.; Borics, A.; Lovas, S.; Al-Khrasani, M.; Fürst, Z.; Tóth, G.; Benyhe, S.; Tourwe, D.

Endomorphin-2 with a beta-turn backbone constraint retains the potent mu-opioid receptor agonist properties.

J. MED. CHEM. 2008, 51, 173-177.

Borics, A.; Murphy, R. F.; Lovas, S. Optical spectroscopic elucidation of beta-turns in disulfide bridged cyclic tetrapeptides.

BIOPOLYMERS 2007, 85, 1-11.

Tóth, G.; Borics, A.

Closing of the flaps of HIV-1 protease induced by substrate binding: A model of a flap closing mechanism in retroviral aspartic proteases.

BIOCHEMISTRY 2006, 45, 6606-6614.