László PUSKÁS

Laboratórium vezető

Tel: 36-62-599-782

puskas.laszlo@brc.hu



Szolgáltatás

Genomikai egység

DNS microarray technológia

DNS-microarray technológia segítségével az egyes sejtekben egy adott időpontban jelenlévő géntermékek (a mRNS molekulák összessége) egyetlen lépésben analizálható, így az adott sejt teljes génműködési mintázata egy adott időpontban meghatározható. Nyomon követhetők a sejtek különböző hatásokra történő (pl. gyógyszeres kezelés, patológiás folyamatok) változásai, lehetővé válik új biokémiai utak felderítése, gyógyszerek hatásmechanizmusainak nyomon követése, fiziológiailag eltérő állapotokért (pl. betegség esetén) felelős gének felfedezése, ipari folyamatok optimalizálása. A technológia alkalmas mind genexpresszós változások nyomon követésére, mind miRNS valamint metilációs mintázat elemzésére. Laboratóriumunk az Agilent cég hibridizációs rendszerét optimalizálta és használja a módszerhez szükséges összes magas színvonalú eszközzel (Agilent konfokális lézer szkenner) és az adatfeldolgozáshoz szükséges szoftverekkel (Feature Extraction és GeneSpring analizáló és klaszterező, valamint statisztikai analízis programok). A cég katalógus lemezei mellett a rendszer alkalmas olyan chipek tervezésére, melyeken egyszerre 2, 4 vagy akár 8 hibridizálás is elvégezhető, a lemezek felülete adott elrendezés mellett bármely faj bármely szekvenciáit (akár saját tervezés, akár az adatbázisban elérhető szekvenciákat) tartalmazhatja tetszőleges számban. A tervezés a cég saját honlapján keresztül online történik.

 

Valós idejű PCR (qPCR) technológia

A real-time PCR technika nukleinsavak (DNS, RNS) abszolút (ehhez azonban ilyenkor kalibrációs görbe felvétele szükséges) és relatív kvantitatív vizsgálatára ad lehetőséget. Alkalmas génexpressziós vizsgálatokra, kópiaszám meghatározásra, DNS microarray, RNAseq, újgenerációs (NGS) szekvenálás kísérletekkel kapott eredmények validálására, illetve polimorfizmusok, SNP-ék detektálásra. A módszer a PCR technikán alapul, a szintézis lépés után minden egyes ciklusban a gép detektálja az aktuálisan jelenlévő kettős szálú DNS-hez kötődő fluoreszcens festék (SybrGreen módszer), illetve a bekötődő jelölt hibrizidáló próbából (TaqMan próba) származó fluoreszcencia intenzitását. Ez a fluoreszcencia intenzitás arányos a reakció elegyben jelenlévő DNS mennyiségével alkalmassá téve ezt a módszert a kiindulási DNS mennyiségek meghatározására. Laboratóriumunkban a Corbett Research RotorGene 3000 real-time PCR gép működik. Egyszerre 36 illetve 72 minta analízisét teszi lehetővé maximum 20ul reakció elegyben. A 72 mintahelyű rotorba speciális 100ul űrtartalmú, négyesével összehegesztett műanyag csövek szükségesek. A sikeres kvantifikálás egyik legfontosabb lépése a primerek és a próba körültekintő megtervezése, az adatok megfelelő interpretálása. Együttműködéses alapon vállaljuk az összes kísérleti lépés megtervezését és kivitelezését a primer tervezéstől az adatok kiértékeléséig.

 

Digitális PCR (dPCR) technológia

A digitális PCR olyan PCR alapú technológia, mely lehetővé teszi nagyon kis mennyiségű nukleinsav abszolút - a QCPCR relatív mennyiségi meghatározásával ellentétben - kalibrációs görbe nélküli, mennyiségi analízisét nagy pontossággal. A reakció elegy nanoliteres szétoszlatásával elérhető, hogy egy -egy reakció egységben egy illetve nulla templát DNS kerüljön, így megfelelő Poisson korrekció és statisztika után a reakció elegyben lévő molekulák száma meghatározható. A módszer rendkívül érzékeny, így alkalmas egysejt genomikai munkákhoz, kópiaszám meghatározáshoz, ritka szekvenciák, mutációk, allélek kimutatására alap és klinikai kutatásokban, biomarker illetve diagnosztikai kutatásokhoz (vérben keringő sejt mentes nukleinsavak, cfRNS, miRNA). Laboratóriumunkban a BioRad cég QX200 Droplet Digitális rendszere működik minden szükséges hardware és software háttérrel optimalizált körülmények között.
 


 

RNAscope in situ hibridizáció (ACDBio)

Az RNAscope technológia egy forradalmian új in situ hibridizációs módszer specifikus RNS molekulák intakt sejten belüli kimutatására. Kimagasló specificitás és érzékenység valamint kvantitálhatóság jellemzi a különleges próba tervezésnek köszönhetően. A Z alakú próbák alsó szakasza (18-20bp) specifikus a target szekvenciára, amit egy összekötő szekvencia rész a felső (14bp) farok szekvenciához kapcsol. Két egymás mellett szorosan kapcsolódó Z próba együttesen formál egy 28bp hosszú szekvencia részt, amelyhez egy jelsokszorozó rendszeren keresztül fluoreszcens festék kapcsolódik. A kiemelkedő specificitást az adja, hogy csak két egymás mellett hibridizáló próba képes fluoreszcens jelet adni. A módszer mind frissen fagyasztott, mind fixált, fagyasztott, mind paraffinba ágyazott mintákon működik. Lehetőség van akár 12 próba egyidejű használatára, így adott pillanatban egy metszeten 12 génexpressziós minta detektálható. Ez a módszer kiváló az egyéb kvantitatív módszerek validálására, kiegészítésére. Laboratóriumunkban az ACDBio cég RNAscope rendszere működik.
 

 

A citometriás egység műszerei

Egysejt tömeg citométer (Helios, Fluidigm): 135 csatornás citométer, melynél az antitestek stabil, monoizotópos fémekkel jelöltek, jelenleg egyszerre 42 fehérje vizsgálatára van lehetőség egysejt szinten. A biológiai minták complex analízisére Cytobank, Astrolabe, Maxpar Pathsetter platformokat használunk.

 

Beckman Coulter Cytoflex S áramlási citofluoriméter: 4 lézerrel (405 nm, 488 nm, 561 nm, 638 nm) és 96-os microtiter tálca automata minta adagolóval rendelkező analizátor. Az SSC és FSC csatornák mellett egyidejűleg akár 13 marker vizsgálható egysejt szinten. Az adatkiértékeléshez a Cytexpert szoftver mellett a Kaluza programot használjuk.


 

Beckton Dickinson Jazz áramlási citofluoriméter szorter: 2 lézerrel (405 nm, 488 nm) rendelkező kétutas sejtszorter.

 

Becton Dickinson FACSCalibur áramlási citofluoriméter: 2 lézerrel (488 nm, 633 nm) rendelkező analizátor. A CellQuest és Modfit szoftverek elérhetőek a kiértékeléshez.

 

Luminex MagPix: multiplex, mágneses gyöngy alapú fehérjék mennyiségi meghatározására való műszer. Maximum 50 fehérje vizsgálható mintánként és 80 minta helyezhető egy 96 lyukú lemezre. Az adatkiértékeléshez a Milliplex szoftver elérhető.