Kutatás - Központi Laboratóriumok - Szekvenáló Platform

NAGY István
tudományos munkatárs

picture
BOROS Éva tudományos munkatárs, fiatal kutató
BORÁK Nikoletta laboráns

SZEKVENÁLÓ PLATFORM

A BAYGEN Intézet Szekvenáló Platformjának MTA SZBK-ba való integrációjával létrejött a régió legjobban felszerelt Szekvenáló Platformja. Az új platform a kapilláris elektroforézis (CE) valamint az Újgenerációs Szekvenálás (NGS) területén is csúcsminőségű készülékeket működtet:

  • 2 db 8 kapillárisos, 3500-as szériájú Genetic Analyzer (Life Technologies)
  • 1 db SOLiD 4 (Life Technologies)
  • 1 db SOLiD 5500xl (Life Technologies)
  • 1 egység EZ Bead System, amely egy automata minta-előkészítő rendszer
  • egyedi szekvenciaanalizáló szoftverekkel felszerelt bioinformatikai egység

Kapilláris elektroforézis

DNS szekvenálás

A genetikai variabilitás meghatározására alkalmazott legpontosabb módszer a Sanger szekvenálás. A Life Technologies kapilláris elektroforézis platformja egyidejűleg kínálja a legpontosabb, leghatékonyabb és széles körben elterjedt technológiát a DNS szekvenálás elvégzéséhez. A 3500-as sorozat a Life Technologies BigDye® Cycle Sequencing Kitjével együtt a korábbiaknál még nagyobb automatizáltságot, pontosabb adatellenőrzést és egyszerűbb használatot biztosít. A 3500-as sorozat jellemzője a gyorsaság, pontosság, reprodukálhatóság és számos lehetőség a DNS leolvasás hosszának meghatározására. A rendelkezésre álló specifikus szekvenáló modulok használatával - például a BigDye® XTerminator™ Purification Kit felhasználásával - tisztított minták analízise során a szekvenciák minősége tovább növekszik.

Fragmentanalízis

A 3500-as sorozat 6 különböző fluoreszcens festék egyidejű detektálására alkalmas, ezzel lehetővé téve a fragmentanalízis során a multiplexelhetőség növelését, így biztosítva a futásonkénti nagyobb adatmennyiséget és az egy mintára jutó futtatási költség csökkentését.

Újgenerációs szekvenálás (Next Generation Sequencing; NGS)

A genomikai megközelítés bevezetése a molekuláris biológiába radikálisan átalakította napjaink kísérletes biológiáját és lehetővé tette az élő rendszerek molekuláris működésének gyorsabb, átfogóbb megismerését. A genomika genom léptékű analízist jelent, vagyis azt, hogy a vizsgálatok kiterjednek az adott élőlény illetve egy populáció teljes DNS-szintű (szerkezeti- és metagenomika) illetve expressziós-szintű (gén-, mikroRNS-, fehérje-kifejeződés: funkcionális genomika; expressziós hálózatok: rendszerbiológia) vizsgálatára. A genomikai alkalmazások elsősorban a gének funkcióinak megértésében játszanak szerepet, amely: 1) az alapkutatásban mind a molekuláris- mind a sejtbiológiában folyamatos szemléletváltást eredményez; 2) az alkalmazott kutatások szempontjából mindenekelőtt a biomedicinában, mezőgazdaságban illetve igazságügyben hasznosítható tudást eredményez.

A genomika a világ legfejlettebb országaiban hihetetlen tempóban fejlődik, erre a legjobb példa az emberi genom feltárása, melyet a 90-es évek elején kezdtek és 2001-ben fejeztek be. Akkor ennyi időre volt szükség a ~3 milliárd bázispár sorrendjének meghatározásához, ezzel szemben ma, mindössze 11 évvel később egy forradalmian új technológiának köszönhetően ez a feladat néhány hét alatt megoldható. A genomika nyugaton már betört a mindennapi orvoslásba is, az USA-ban számos cég alakult, amely már magánszemélyek számára is hozzáférhetővé teszi a genomikai szolgáltatást.

A kétezres évek közepén piacra került Újgenerációs szekvenálók (Next Generation Sequencing; NGS) napjaink vezető, teljes genom-szintű vizsgálatainak, az ún. ultra-magas áteresztőképességű szekvenálás technikai megvalósítását teszik lehetővé. Ezen műszerek segítségével szerteágazó biológiai minták vizsgálatára nyílik lehetőség, kezdve a mikrobák filogenetikai törzsfáinak vizsgálatával, a kromatin immunprecipitációt követő szekvenáláson keresztül (ChIP-Seq) a gének kópiaszámának vizsgálatáig (alant részletezve).

A Szekvenáló Platformunk által működtetett SOLiD rendszerek (S4 és 5500xl) forradalmian új genetikai analizátor platformok, amelyek lehetőséget biztosítanak gyöngyökhöz kötött, klonálisan amplifikált DNS fragmentumok tömeges párhuzamos szekvenálására. A szekvenálási módszer festékkel jelölt oligonukleotidok egymást követő ligálásán alapul. Az ultramagas teljesítmény és páratlan pontosság széles alkalmazási rugalmassággal párosulva egyedülálló rendszert biztosít.


A rendszer fő jellemzői


Teljesítmény >60GB/futás térképezhető szekvenciát, azaz >600 millió szekvencia-szakaszt („tag”-et) állít elő futásonként >225GB/futás térképezhető szekvenciát, azaz >1,5 milliárd szekvencia-szakaszt („tag”-et) állít elő futásonként
Olvasási hossz fragment könyvtár esetén 50 bázispár
„mate-paired” könyvtár esetén 2x50 bázispár
fragment könyvtár esetén 75 bázispár
„mate-paired” könyvtár esetén 2x75 bázispár
Inszert méret „mate-paired” könyvtár esetén 600 bp-tól 10000 bp-ig
Szekvenálási kémia ligálás alapú, 2-bázis-kódoló rendszerrel megismételhető ligálási lépések
Pontosság a kétbázisonkénti kódolásnak köszönhetően >99,94%
Multiplex kísérletek kémiai „vonalkódozás” (barcoding) segítségével - csökkenő egységköltség
Kiinduló minta vérből, BAC-ból, plasmid-ból, fosmid-ból, szövetből, sejtekből (akár néhány sejtből is), PCR termékből izolált DNS vagy cDNS
totál RNS vagy tisztított mRNS/mikroRNS populációk
Kiinduló minta mennyisége fragmens DNS könyvtárhoz: 20ng - 2g (cc >400ng/μl)
„mate-paired” DNS könyvtárhoz: 5μg - 20μg (cc >400ng/μl)
totál és mRNS esetén: >5μg (cc >400ng/μl; RIN > 8.0)
mikroRNS esetén: >100ng

Alkalmazási területek

Az ultra-magas áteresztőképességüknek köszönhetően az újgenerációs szekvenálók széleskörű analízisre használhatók:

  • de novo szekvenálás (ismeretlen genomú faj szekvenálása, majd nukleotidsorrendjének (genomjának) meghatározása),
  • újraszekvenálás (ismert referenciagenomú fajok szekvenálása, pl. baktériumok filogenetikai rendszerezése, szekvenciavariációk és SNP-k azonosítása),
  • összehasonlító-, meta-, populációgenomika
  • gén-kifejeződés (RNA-Seq; Digital Gene Expression Profiling, DGEP),
  • haplotípus meghatározás,
  • mikroRNS-kifejeződés, -azonosítás,
  • kromatin immunprecipitációt követő szekvenálás (ChIP-Seq; transzkripciós faktorok kötőhelyeinek azonosítása; aktív vagy passzív kromatin feltérképezése),
  • DNS metilációs analízis (Meth-Seq).

Amennyiben igénybe szeretné venni a Platform által nyújtott szolgáltatásokat, kérjük keressen bennünket a következő elérhetőségeken:
tel/fax: +36-62-599-672

Válogatott közlemények

Nagy I., Filkor K., Németh T., Hamari Zs., Vágvölgyi Cs. and Gácser A. (2011) In vitro interactions of Candida parapsilosis wild type and lipase deficient mutants with human monocyte derived dendritic cells. BMC Microbiology, 11:122.

McDowell A., Gao A., Barnard E., Fink C., Murray P.I., Dowson C.G., Nagy I., Lambert P.A. and Patrick S. (2011) Novel Multilocus Sequence and Multiplex PCR Typing Schemes for the Opportunistic Pathogen Propionibacterium acnes and Characterisation of Type I Cell-Surface Associated Antigens. Microbiology 157: 1990-2003.

Hunyadkürti J., Feltóti Zs., Horváth B., Nagymihály M., Vörös A., McDowell A., Patrick S., Urbán E. and Nagy I. (2011) Complete Genome Sequence of Propionibacterium acnes Type IB strain 6609. Journal of Bacteriology vol: 193, issue 17; 4561-4562

Horváth B., Hunyadkürti J., Vörös A., Fekete C, Urbán E., Kemény L. and Nagy I. (2012) Genome Sequence of Propionibacterium acnes Type II strain ATCC11828. Journal of Bacteriology vol: 194, issue 1; 202-203.

Kriszt B., Táncsics A., Cserháti M., Tóth Á., Nagy I., Horváth B., Nagy I., Tamura T., Kukolya J. and Szoboszlay S. (2012) De novo genome project of the oil degrader Rhodococcus pyridinivorans AK37. Journal of Bacteriology vol : 194, issue 5; 1247-1248.

Csepregi K., Valasek A., Pénzes Á., Tóth Z., Kiss É.Í., Kerepesi I., Horváth B., Nagy I. and Fekete C. (2012) Draft Genome Sequence of an Efficient Antibiotics Producing Industrial Strain (SZMC 14600) of Saccharomonospora azurea. Journal of Bacteriology vol : 194, issue 5; 1263.

Vörös A., Horváth B., Hunyadkürti J., McDowell A., Barnard E., Patrick S. and Nagy I. (2012) Complete genome sequence of three Propionibacterium acnes isolates from the type IA2 cluster. Journal of Bacteriology vol: 194, issue 6; 1621-1622.

Cserháti M, Kriszt B., Szoboszlay S., Tóth Á, Szabó I., Nagy I., Horváth B., Nagy I. and Kukolya J. (2012) De novo genome project of Cupriavidus basilensis strain OR16. Journal of Bacteriology vol: 194, issue 8; 2109-2110.

McDowell A., Hunyadkürti J., Horváth B., Vörös A., Bernard E., Patrick S. and Nagy I. (2012) Draft Genome Sequence of an Antibiotic Resistant Propionibacterium acnes Strain PRP-38 from the Novel Type IC Cluster Journal of Bacteriology vol: 194, issue 12; 3260-3261.

McDowell A., Barnard E., Nagy I., Gao A., Tomida S., Li H., Eady A., Cove J., Nord C.E. and Patrick S. (2012) An Expanded Multilocus Sequence Typing Scheme for Propionibacterium acnes: Investigation of 'Pathogenic', 'Commensal' and Antibiotic Resistant Strains PLoS One vol: 7, issue 7; e41480.

Nagy E., Urbán E., Becker S., Kostrzewa M., Vörös A., Hunyadkürti J. and Nagy I. (2013) MALDI-TOF MS fingerprinting facilitates rapid discrimination of phylotypes I, II and III of Propionibacterium acnes. Anaerobe vol: 20; 20-26.

Ördögh L., Hunyadkürti J., Vörös A., Horváth B., Szűcs A., Urbán E., Kereszt A., Kondorosi É. and Nagy I. (2013) Complete Genome Sequence of Propionibacterium avidum isolated from human skin abscess Genome Announcements 1(3):e00337-13.

Tóth Á., Barna T., Nagy I., Horváth B., Nagy I., Táncsics A., Kriszt B., Baka E., Fekete C. and Kukolya J. (2013) Genome Sequence of the lignocellulose decomposer Thermobifida fusca TM51 Genome Announcements 1(4):e00482-13.

Fodor E., Zsigmond Á., Horváth B., Molnár J., Nagy I., Tóth G., Wilson S.W. and Varga M. (2013) Full transcriptome analysis of early dorsoventral (DV) patterning is zebrafish. PLoS One 8(7): e70053. doi:10.1371/journal.pone.0070053.

Szász A., Strifler G., Vörös A., Váczi B., Tubak V., Puskás LG., Belső N., Kemény L. and Nagy I. (2013) TAM receptors and their ligand Gas6 are downregulated in psoriasis. Journal of Dermatological Sciences vol: 71; 215-216.

Jasson F., Nagy I., Knol AC., Zuliani T., Khammari A. and Dréno B. (2013) Different strains of Propionibacterium acnes modulate differently the cutaneous innate immunity. Experimental Dermatology vol: 22; 587-592.

Filkor K., Hegedűs Z., Szász A., Tubak V., Kemény L., Kondorosi É. and Nagy I. (2013) Genome wide transcriptome analysis of dendritic cells identifies genes with altered expression in psoriasis. PLoS One 8(9): e73435. doi:10.1371/journal.pone.0073435.

McDowell A., Nagy I., Magyari M., Barnard E. and Patrick S. (2013) The opportunistic pathogen Propionibacterium acnes: insights into typing, human disease, clonal diversification and CAMP factor evolution evolution. PLoS One 8(9): e70897. doi:10.1371/journal.pone.0070897.

Roller M., Lucić V., Nagy I., Perica T. and Vlahoviček K. (2013) Environmental shaping of codon usage and functional adaptation across microbial communities. Nucleic Acids Research 41 (19): 8842-8852.

Lázár V., Singh G.P., Spohn R., Nagy I., Horváth B., Hrtyan M., Busa-Fekete R., Bogos B., Méhi O., Csörgő B., Pósfai G., Fekete G., Szappanos B., Kégl B., Papp B. and Pál C. (2013) Bacterial evolution of antibiotic hypersensitivity. Molecular Systems Biology 9:700

Szalai Z., Szász A., Nagy I., Puskás LG., Kupai K., Király A., Berkó A., Pósa A., Strifler G., Baráth Z., Nagy LI., Szabó R., Pávó I., Murlasits Z, Gyöngyösi M. and Varga C. (2014) Anti-inflammatory effect of recreational exercise in TNBS induced colitis in rats: role of NOS/HO/MPO system Oxidative Medicine and Cellular Longevity Article ID: 925981.

Nyerges Á., Csörgő B., Nagy I., Latinovics D., Szamecz B., Pósfai G. and Pál C. (2014) Conditional DNA repair mutants enable highly precise genome engineering. Nucleic Acids Research 42 (8):e62

Salamó I.P., Papdi C., Rigó G., Zsigmond L., Vilela B., Lumbreras V., Nagy I., Horváth B., Domoki M., Darula Z., Medzihradszky K., Koncz C., Bögre L. and Szabados L. (in press) The heat shock factor HSF4A4 confers salt tolerance and is regulated by oxidative stress and the MAP kinases, MPK3 and MPK6. Plant Physiology

Joseph M.P., Papdi C., Kozma-Bognár L., Nagy I., López-Carbonell M., Koncz C. and Szabados L. (in press) The Arabidopsis Zinc Finger Protein 3 interferes with ABA and light signalling in seed germination and plant development. Plant Physiology

Lázár V., Nagy I., Spohn R., Csörgő B., Györkei Á., Nyerges Á., Horváth B., Vörös A., Busa-Fekete R., Hrtyan M., Bogos B., Méhi O., Fekete G., Szappanos B., Kégl B., Papp B. and Pál C. (in press) Genome-wide analysis captures the determinants of the antibiotic cross-resistance interaction network. Nature Communications