Kutatás - Központi Laboratóriumok - Mikroszkópos Sejtanalízis Laboratórium

AYAYDIN Ferhan
tudományos főmunkatárs

picture
ZOMBORINÉ NAGY Bettina tudományos munkatárs
RÁDI Feríz PhD hallgató
VALKONYNÉ KELEMEN Ildikó laboráns/ügyvivő szakértő

MIKROSZKÓPOS SEJTANALÍZIS LABORATÓRIUM

Egyetlen kép, tartja a mondás, ezer szóval felér. Az új mikroszkópiás technikák kifejlesztésének köszönhetően, napjaink biológiai és orvosi kutatása egyre inkább függővé vált a mikroszkópos képanalízistől. Ezek a technikák napjainkban lehetővé teszik szinte bármelyik molekula specifikus jelölését és ezáltal funkciójának közvetlen analízisét élő sejtekben, élőlényekben. Az új fejlesztések egyedi módon teszik lehetővé az alapvető sejtfolyamatok bonyolult tér-idő dinamikájának direkt megjelenítését és vizsgálatát. Laboratóriumunk egyik célja, hogy a legújabb képalkotó technikák, fluoreszcens jelölés és biokémiai technikák bevezetésével, és azok továbbfejlesztésével lehetővé tegye magunk és mások számára a komplex sejten belüli és sejtek közötti rendeződések és folyamatok megértését és vizsgálatát. Elért legújabb eredményeink közé sorolhatjuk a gyors és hatékony etinil dezoxiuridin (EdU) alapú replikációs analizis növényekre való használatának kidolgozását, (ii) újszerű fluoreszkáló festékek felfedezését és elemzését a növényi olaj cseppek vizsgálatához, (iii) az oligonukleotid irányitott mutagenezisre alapozott gén-specifikus genom szerkesztésének hatékonyság növelését a mutáns GFP és fluoreszkáló képalkotási technikák segítségével.


Mikroszkópos Sejtanalízis Laboratóriumunkban csúcstechnológiai lézer-pásztázó konfokális mikroszkópok, fluoreszcens és sztereo mikroszkópok, valósidejű élősejt-analízist lehetővé tevő mikroszkópos állomás, kétfoton mikroszkóp és lézer mikrodisszekciós mikroszkóp található. Ezekkel a modern műszerekkel többek között háromdimenzióban fehérje lokalizációt és mobilitás vizsgálatot, valamint időbeli dinamikai analízist végezhetünk élő sejtekben, szövetekben, szervekben. A biológiai és orvosi alkalmazások mellett, a lézer-pásztázó mikroszkópiának ipari alkalmazásai is vannak, mint például a mikro-elektromechanikai rendszerek vizsgálata, meghibásodás illetve hajszálrepedések tesztelése, ellenőrzése. Úgyszintén számos alkalmazhatósága van az anyagtudományok terén is.


Újszerű replikációs analízis módszer növényekben, mikroszkópia és citometria együttes alkalmazásával

A sejtosztódás DNS szintézis fázisában (S-fázis) lévő sejtek jelölése, detektálása és kvantifikálása kulcsfontosságú a vizsgálandó sejtek különböző kezelésekre és genetikaimódosításokra való válaszának elemzése során. A sejtek bromdezoxiuridinnel-való (BrdU) jelölése és ellenanyaggal való detektálása eddig az S-fázis leggyakrabban használt elemzési módszere volt. Az ellenanyaggal való BrdU detektálás módszere savas vagy nukleázzal történő, nem kíméletes lépéseket tartalmaz. A növényi sejtfalak külön akadályt okoznak az ellenanyag-függő módszerek alkalmazásában, ezért sejtfalemésztést igényelnek. Ezek a lépések nem csak időigényesek hanem a sejt morfológiáját is torzítják. Konfokális lézer-pásztázó mikroszkópia és áramlásos citometria együttes használatával kimutattuk, hogy az újszerű etinil dezoxiuridin alapú módszer kifejleszthető és számos szempontból előnyösebb a bromdezoxiuridin metodikával szemben, növények esetében. Laboratóriumunk közleményeinek köszönhetően ez az újszerű replikációs analízis technika a növényi sejtciklus/sejtosztódás kutatás területén egyre népszerűbbé vált. (Kotogany et al., 2010, Ayaydin et al., 2011, Kuntam and Ayaydin, 2015)


Újszerű replikációs analízis módszer növényekben


Új fluoreszkáló festékek növényi olajcseppek jelölésére

A növényi olajcseppek (Lipid droplets) nagyon dinamikusak. A proteomikai analízisek kimutatták, hogy számos különböző fehérje helyezkedik el a növényi olajcseppek felületén. Mindemellett, kevés tudással rendelkezünk az olajcseppek fehérje és lipidtartalma szabályozottságáról, a különböző fehérjék olajcseppekre való jutásának mechanizmusairól, az olajcseppek kialakulásáról, illetve, a sejten belüli mozgásukról. Ezért az élősejtekben végzett dinamikus analízisek nagyon fontos szerepet játszanak ezen organellum biológiájának megértésében. Kutatásaink során kimutattuk, hogy a talidomid alapú újszerű, olajcsepp jelölő fluoreszkáló festékek használata kifejezetten előnyös az élő-növényi sejtek 3 dimenziós, mikroszkópos analízisére. Kék fluoreszkáló színüknek köszönhetően, ezek az új festékek zöld és piros színű más festékekkel és fluoreszkáló fehérjékkel is kombinálhatóak. (Kuntam et al., 2015)


Új fluoreszkáló festékek a növényi olajcsepp jelöléséhez


Hatékonyság növelés az oligonukleotid irányított mutagenezisre alapozott genom szerkesztésben

A mutációs nemesítés és a gén-transzfer alapú genetikai módosítás (GMO) technikák alternatívájaként alkalmazható gén-specifikus genom szerkesztési technika fontos szerepet játszhat a növénynemesítésben. Oligonukleotid irányított mutagenezis (ODM) mint módszer a gén-specifikus nukleotid csere (TNE) technikákban különösen kulcsszerepet játszhat mind az alapkutatás területén mind a növénynemesítésben. Viszont, ennek a technikának az egyik fő korlátja a nukleotid csere események rendkívül alacsony gyakorisága. Eggyüttműködve Dudits Dénes professzorral (MTA, Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Növénybiológiai Intézet),a kromatin módosító vegyszerek segítségével és a mutáns GFP fehérje használatával szignifikáns hatékonyság emelést értünk el a nukleotid csere eseményekben kukorica sejtek esetében. Úgy gondoljuk, hogy ezen a területen elért eredményeink nem csak alapkutatásban hanem transzgén-mentes növénynemesítés területén is fontos szerepet fognak játszani (Tiricz et al, 2015).


Mutáns GFP fluoreszcencia helyreállítása oligonukleotid-irányított mutagenezis technikával

Válogatott közlemények

Ayaydin, F., Vissi, E., Meszaros, T., Miskolczi, P., Kovacs, I., Feher, A., Dombradi, V., Erdodi, F., Gergely, P. and Dudits, D. (2000). Inhibition of serine/threonine-specific protein phosphatases causes premature activation of cdc2MsF kinase at G2/M transition and early mitotic microtubule organization. Plant J. 23(1):85-96.

Ayaydin, F. and Dasso, M. (2004). Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol. Biol. Cell 15(12):5208-5218.

Kotogány, E., Dudits, D., Horváth, V.G. and Ayaydin F. (2010). A rapid and robust assay for detection of S-phase cell cycle progression in plant cells and tissues by using ethynyl deoxyuridine. Plant Methods (6:5)

Ayaydin, F., Kotogány E., Ábrahám E and Horváth V.G. (2011). Synchronization of Medicago sativa Cell Suspension Culture. Methods Mol Biol. 761:227-238.

Kuntam S., Puskás L.G., Ayaydin F. (2015). Characterization of a new class of blue-fluorescent lipid droplet markers for live-cell imaging in plants. Plant Cell Rep. 34:655-665.

Ayaydin F., Biro J., Domoki M., Ferenc G., Feher A. (2015) Arabidopsis NAP-related proteins (NRPs) are soluble nuclear proteins immobilized by heat. Acta Phy. Plant 37: Paper 3. 8 p.

Kuntam S. and Ayaydin F. Detection of S-phase of cell division cycle in plant cells and tissues by using 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) (2015) in Plant Microtechniques: Methods and Protocols. Eds. Yeung C.T.E., Stasolla C, Sumner M.J., Huang B.Q. Springer, pp. 311-322.

Dudits D., Török K., Cseri A., Paul K., Nagy A.V., Nagy B., Sass L., Ferenc G., Vankova R., Dobrev P., Vass I., Ayaydin F. (2016) Response of Organ Structure and Physiology to Autotetraploidization in Early Development of Energy Willow Salix viminalis. Plant Physiol. 170:1504-1523.

Tiricz H., Nagy B., Ferenc G., Török K., Nagy I., Dudits D. and Ayaydin F. (2017) Relaxed chromatin induced by histone deacetylase inhibitors improves the oligonucleotide-directed gene editing in plant cells. J Plant Res. Aug 23.

Fodor E and Ayaydin F. (2018, in print) Fluorescent probes and live imaging of plant cells. “Advances in Plant Ecophysiology Techniques” Eds: Reigosa MJ, Sánchez-Moreiras A. Publisher: Springer..