PÁLI Tibor
tudományos tanácsadó

picture
SZALONTAI Balázs tudományos tanácsadó
KÓTA Zoltán tudományos munkatárs
SEBŐKNÉ NAGY Krisztina tudományos munkatárs
KÓNYA Erika laboráns

A csoport saját honlapja >>

BIOMEMBRÁNOK ÉS MEMBRÁNFEHÉRJÉK FUNKCIONÁLIS SZERKEZETBIOLÓGIÁJA

A csoport fő kutatási témái: a protont szállító membránfehérje komplex, a vakuoláris proton-ATPáz (V-ATPáz); vízoldékony és transz-membrán alfa-hélix és béta-szalag polipeptid kötegek; natív és modell biomembránok molekuláris kölcsönhatásai. Ezek a témák nagyon szoros kapcsolatban vannak egymással tematikailag és metodikailag is. E biológiai objektumokban a szerkezet-funkció kapcsolat, a membránfehérjék és polipeptidek gombolyodása és szerveződése, valamint a fehérje-oldószer határfelület különleges funkcionális és szerkezeti szerepe érdekel minket leginkább. A spektroszkópián és kalorimetrián alapuló funkcionális szerkezetbiológiai megközelítésünk ezeken a módszereken nyugszik: membránfehérje tisztítás, Fourier-transzformációs infravörös (FTIR), helyspecifikus (spinjelző) elektron paramágneses rezonancia (EPR), UV, látható és fluoreszcencia spektroszkópia, valamint nagy érzékenységű differencia pásztázó kalorimetria (DSC). A működő bio- és modellmembrán rendszereken kapott szerkezeti, dinamikai és termodinamikai adatok felhasználásával funkcionálisan releváns molekula és fizikai modelleket készítünk - ez a funkcionális szerkezetbiológia.


Egy membrán-kötött, protont szállító molekuláris motor: a vakuoláris proton-ATPáz

1. ábra: A V-ATPáz forgó mechanizmusa. Mindegyik c alegységhez kötődik proton, amikor azok lipidekke érintkeznek. A protonok a c és a alegységek közötti hidrofil zsákokon keresztül érkeznek és távoznak a kötőhelyükről (Ferencz és mtsai., 2013 alapján).

Az eukarióta sejtek belső kamráinak közege savasabb kémhatású, mint a citoplazmáé. A transzport fehérje komplex, amely ezt a pH különbséget biztosítja, az a természet leguniverzálisab proton pumpája: a vakuoláris proton-ATPáz. A V-ATPáz egy molekuláris forgómotornak tekinthető, amely az ATP hidrolíziséből nyert kémiai energiát a rotor domén forgatására használja, bizonyos alegységek közötti forgatónyomaték generálásával, ami pedig a kar és a rotor domének közötti határfelületen megvalósuló, a membránon keresztüli proton szállítást eredményez. Kutatásaink a V-ATPáz működésének következő aspektusaira fókuszálnak: alegység-alegység és alegység-lipid kölcsönhatás, szintetikus gátlóanyagoknak a funkcióra és az alegységek szerveződésére gyakorolt hatása, a passzív proton szállítás és az ATP hidrolízis szétválaszthatósága, valamint a forgó mechanizmus vizsgálata (1. ábra). A közelmúltban meghatároztuk a natív környezetében, tehát vakuoláris membránvezikulában működő élesztő V-ATPáz rotorjának forgási frekvenciáját. Ezzel elsőként sikerült a forgási frekvencia megmérése olyan V-ATPázban, amelyen sem genetikai, sem kémiai módosítást nem kellett eszközölni, és nem kellett szilárd hordozóra rögzíteni. Felfedeztük azt is, hogy oszcilláló transz-membrán elektromos tér befolyásolja a V-ATPáz aktivitását. Jelenleg a külső elektromos tér hatását felhasználjuk arra, hogy többet megtudjunk a forgó mechanizmusról.


Fehérjék behatolása, gombolyodása és szerveződése membránokban és membránokon

2. ábra: A gramicidin A kétféle membránbeli konformációja. Középütt egy foszfolipid molekula látható (Kota és mtsai., 2004 alapján).

A membránfehérjék gombolyodásának megértése ma a biofizika egyik legnagyobb kihívása, mert ezek makromolekulák és a membránlipidek szerkezetileg, dinamikailag és funkcionálisan is csatolódnak egymáshoz. A lipid-fehérje határfelületnek több formája is van, és ezek mindegyike fontos a biológiai működéshez. A membránfehérjék gombolyodásának megértéséhez tehát foglalkozni kell mind a lipidek, mind a fehérjék szerkezetével, dinamikájával és funkciójával is. Tisztított membránfehérjék aktivitásának méréséhez szükséges feltétel, hogy azok a lipid kettősrétegbe épülve megfelelően szerveződjenek össze. Célunk kiválasztott polipeptidek és fehérjék membránban vagy azok felszínén való gombolyodását és szerveződését szabályozó faktorokról spektroszkópiai és kalorimetriás adatok mérése. Ezek az adatok perem- és kezdetérték feltételeket szabnak molekula és fizikai modelljeinkhez. Jelenleg a fehérjék háromféle csoportjával foglalkozunk: transz-membrán hélix és béta-szalag kötegek (V-ATPáz alegységek és E.coli pórusfehérjék), és bio- és modell membránokkal kölcsönható vízoldékony fehérjék és polipeptidek (gramicidin A, lizozim) (2. ábra).


Membránfehérjék molekulamodellezése

3. ábra: Az M13-as bakteriofág fő burokfehérje szekvenciája és 3-dimenziós gombolyag szerkezete, a szolvatációs, első réteg lipidekkel együtt (Bashtovyy és mtsai. , 2001 alapján).

Membránfehérjék szerkezetbiológiájában jelenleg az jelenti a legnagyobb nehézséget, hogy izolálni és vagy oldatba vinni, vagy kristályosítani kell olyan fehérjéket, amelyek natív környezete a lipid mátrix. Mivel így a szerkezetmeghatározás “idegen” környezetben történik, kérdés, hogy mekkora a korreláció a kapott szerkezetek, tujdonságok és a natív, membránbeli állapot között. Ezért az elméleti módszereknek igen nagy a jelentősége. A 3. ábra a szerkezetbiológia alapvető problémájának lényegét reprezentálja: ha ismerjük egy fehérje szekvenciáját, akkor hogyan tudjuk meghatározni annak natív szerkezetét? Minthogy egy membránfehérje natív szerkezete csak membránkörnyezetben alakul ki és működik, az ábrán a nyíllal jelzett szekvencia-gombolyag szerkezet kódolás csak a fehérje natív környezetében, a membránban érvényes. Ezen okok miatt azt a stratégiát alkalmazzuk, hogy a kiválasztott membránfehérjékről azok funkcionális, natív membránkörnyezetében mérünk szerkezeti adatokat (ld. fentebb). Ezeket az adatokat bioinformatikai és hurok adatbázisokból származtatott információkkal, valamint homológia-alapú predikciókkal kombináljuk molekulamechanikai módszerek segítségével, a célfehérjék 3-dimenziós gombolyag szerkezetének megjóslása céljából. Jó példa a citokróm b561 membránfehérje családban konzervált 4-hélixes transz-membrán köteg 3-dimenziós gombolyag szerkezetének általunk végzett predikciója: több mint két évtizedes próbálkozás ellenére, a fehérjecsalád egyik tagját sem sikerült kristályosítani, így még mindig csak az átlalunk jósolt fehérjeszerkezet áll rendelkezésre. A jövőben redukált (szemcsés) fehérje reprezentációt használó molekulamechanikai algoritmusokhoz fejlesztünk kódot abból a célból, hogy azokat kísérletileg származtatott ún. tudásalapú potenciálokkal bővítsük, és így javítsuk a membránfehérjék szerkezeti predikcióját.


Lipid-fehérje kölcsönhatás biológiai és modell rendszerekben

4. ábra: Rendezett (gél) és rendezetlen (fluid) foszfolipidek. Megjelöltük a lipidek hidrofil és hidrofób részét is.

A biomembránok szigetelő képességét a lipidek biztosítják, amelyek hidrofób kettősrétege megfelelő feltételeket teremt a membránfehérjék működéséhez is. Ezért egyrészt a lipid-fehérje kölcsönhatás minden biomembrán funkció igen lényeges eleme, másrészt izolált membránfehérjék nagyon nehezen tanulmányozhatóak. Csoportunkban nem behatoló és jelzési technikákkal is tanulmányozzuk a lipid-fehérje, ill. általánosabban az oldószer-fehérje határfelületet: spinjelző EPR és a nem behatoló FTIR technikákat használjuk, és fejlesztjük is, modell és biológiai membránok kutatásában. Ezekben a mérésekben a fehérjékhez és lipidekhez tartozó spektrális tartományok jól elkülönülnek. Az FTIR esetében ez a szeparáció különösen jó, és így a lipidek és fehérjék egymástól függetlenül is tanulmányozhatók. A lipid-fehérje kölcsönhatás a két tartományban megfigyelhető korreláló változások segítségével is vizsgálható. Új kiértékelő módszerünkkel sikerült meghatározni a lipidek és fehérjék csatolódásának kulcs elemeit hideg és meleg stressznek kitett biológiai membránokban. A közeljövőben teljes visszaverődéses kristályok felületére növesztett élő sejteknek hőstressz hatására bekövetkező membránszerkezeti változásainak vizsgálatával fogunk foglalkozni. Másik aktuális témánk a “csaknem” egymolekulás mérések fehérjéken, felület erősített FTIR spektroszkópiával, amely lehetővé teszi az infravörös abszorpció mérését csupán egy 8-10 nm-es rétegből. Ezzel a technikával egy intézeti együttműködés keretében a biológiai molekulákat körülvevő víz szerkezetét fogjuk tanulányozni, figyelembe véve a Hofmeister jelenséget is. Hipotézisünk szerint a biológiai molekulák befolyásolják a határfelületi víz rendezettségét. Ilyen effektus fontos szerepet játszhat a molekuláris kölcsönhatásokban, pl. hőstressz fehérjék hatásmechanizmusában. Kis számú molekula megfigyeléséhez nanotechnológiai módszereket használunk, úgymint felületeknek polielektrolitokkal való funkcionalizálása.


Szabadgyökök membránokban, szövetekben és élelmiszer termékekben

Minthogy az EPR spektroszkópia a legmegbízhatóbb és legalkalmasabb módszer szabadgyökök mérésére, több együttműködésünk célja szabadgyökök mérése biológiai mintákban, pl. biomembránokban. Sokféle biológiai hatása miatt a nitrogén monoxid (NO) jelenleg is a biokémiai kutatások fókuszában van. Az NO sok funkciója membránokkal kapcsolatos. Ezért megmértük az NO membránba hatolási profilját, spinjelzett lipidekre gyakorolt hatása alapján. Az SzTE Biokémiai Tanszékével együttműködve rutinszerűen mérjük az NO tartalmat különféle emlős szervekből származó szövetmintákon, mégpedig a spincsapdázás módszerével. Az SzBK Növénybiológiai Intézetével együttműködésben a mono-dehidroaszkorbát szabadgyök szerepét vizsgáljuk fotoszintetikus membránokban. Szintén rutinszerűen mérünk cellulóz eredetű és nem-specifikus szabadgyököket élelmiszeripari termékekben, úgymint paprika és tejpor, szárított hagyma, és legújabban őrölt kávé.

Selected publications

Holzenburg, A., Jones, P.C., Franklin, T., Pali, T., Heimburg, T., Marsh, D., Findlay, J.B.C., and Finbow, M.E. (1993). Evidence for a Common Structure for a Class of Membrane Channels. European Journal of Biochemistry 213(1): 21-30.

Csonka, C., Pali, T., Bencsik, P, Gorbe, A., Ferdinandy, P. and Csont, T. (2015) Measurement of NO in biological samples. British Journal of Pharmacology 172(6), 1620-1632.

Kostrzewa, A., Pali, T., Froncisz, W. and Marsh, D. (2000). Membrane location of spin-labeled cytochrome c determined by paramagnetic relaxation agents. Biochemistry 39(20): 6066-6074.

Bashtovyy, D., Marsh, D., Hemminga, H.M. and Pali, T. (2001). Constrained modelling of spin-labelled major coat protein mutants from M13 bacteriophage in a phospholipid bilayer. Protein Science 10(5): 979-987.

Schwinte, P., Voegel, J.C., Picart, C., Haikel, Y., Schaaf, P., and Szalontai, B. (2001). Stabilizing effects of various polyelectrolyte multilayer films on the structure of adsorbed/embedded fibrinogen molecules: An ATR-FTIR study. J. Phys. Chem. B. 47: 11906-11916.

Kota, Z., Horvath, L.I., Droppa, M., Horvath, G., Farkas, T., and Pali, T. (2002). Protein assembly and heat stability in developing thylakoid membranes during greening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(19): 12149-12154.

Bashtovyy, D., Berczi, A., Asard, H. and Pali, T. (2003). Structure prediction for the di-heme cytochrome b-561 protein family. Protoplasma 221(1-2): 31-40.

Kispeter, J., Bajusz-Kabok, K., Fekete, M., Szabo, G., Fodor, E. and Pali, T. (2003). Changes induced in spice paprika powder by treatment with ionising radiation and saturated steam. Radiation Physics and Chemistry 68(5): 893-900.

Pali, T., Garab, G., Horvath, L.I. and Kota, Z. (2003). Functional significance of the lipid-protein interface in photosynthetic membranes. Cellular Molecular Life Sciences 60(8): 1591-1606.

Kota, Z., Pali, T. and Marsh, D. (2004). Orientation and lipid-peptide interactions of gramicidin A in lipid membranes: polarized ATR infrared spectroscopy and spin-label electron spin resonance. Biophysical Journal 86(3): 1521-1531.

Marsh, D. and Pali, T. (2004). The protein-lipid interface: perspectives from magnetic resonance and crystal structures. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1666(1-2): 118-141.

Laczko-Dobos, H. and Szalontai, B., (2009). Lipids, proteins, and their interplay in the dynamics of temperature-stressed membranes of a cyanobacterium, Synechocystis PCC 6803. Biochemistry 48: 10120–10128. Szalontai, B. (2009). Membrane protein dynamics: Limited lipid control. PMC Biophysics 2: 1.

Nagy, K., Pilbat, A., Groma, G., Szalontai, B, and Frederic J. G. Cuisinier (2010). Casein aggregates built step-by-step on charged polyelectrolyte film surfaces are calcium phosphate-cemented J. Biol. Chem. 285: 38811-38817.

Ferencz, C., Petrovszki, P., Kota, Z., Fodor-Ayaydin, E., Haracska, L., Bota, A., Varga, Z., Der, A., Marsh, D. and Pali, T. (2013). Estimating the rotation rate in the vacuolar proton-ATPase in native yeast vacuolar membranes. European Biophysics Journal 42: 147–158.

Pali, T. and Kota, Z. (2013). Studying lipid-protein interactions with electron paramagnetic resonance spectroscopy of spin-labeled lipids. In: Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 974, Jorg H. Kleinschmidt (ed.), Springer New York 2013: pp. 297-328.

Szalontai, B., Nagy, G., Krumova, S., Fodor, E., Pali, T., Taneva, S.G., Garab, G., Peters, J., and Der, A. (2013) Hofmeister ions control protein dynamics. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects 1830: 4564–4572.

Csonka, C., Pali, T., Bencsik, P, Gorbe, A., Ferdinandy, P. and Csont, T. (2015) Measurement of NO in biological samples. British Journal of Pharmacology 172(6), 1620-1632.

Ferencz, Cs-M., Petrovszki, P., Der, A., Sebok-Nagy, K., Kota, Z. and Pali, T. (2017) Oscillating electric field measures the rotation rate in a native rotary enzyme. Nature – Scientific Reports (accepted for publication).